摘要
常用导尿管多为硅胶材质，体内长期留置容易滋生细菌，引起二次感染，使患者承受二次创伤。已报道的涂层大多稳定性欠佳、制备步骤繁琐，不利于应用。采用改性硅烷聚醚(MS聚醚)为主要涂层材料，3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷(APTS)为功能化分子，在硅胶表面制得含有胺基的MS聚醚涂层(MS-APTS)。MS-APTS涂层中胺基与诺氟沙星(NFX)产生静电吸引后，得到含有NFX的目标抗菌涂层(MS-NFX)。该涂层制备方法简单，可适应复杂表面的涂覆，且经2000次弯折测试后，不脱落，不褶皱，显示出高粘附力和稳定性。MS-NFX涂层可实现长达168 h的NFX有效释放，第168 h的持续释放量为4.84 μg/cm2，可有效抗菌。此外，MS-NFX涂层对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的杀灭效果，其效果与NFX固载量成正比。MS-NFX涂层具有稳定性高、涂覆方法易行、有效抗菌时间长、抑菌效果好等优点，有望在生物医用导管领域应用。
Abstract
The commonly used catheter is made of silicone, which is prone to bacterial growth when left in the body for extended periods, leading to secondary infections for patients. Most of the reported coatings have poor stability and cumbersome preparation steps, which are not favorable for application. Modified silane polyether (MS polyether) was used as the main coating material, with 3-[2-(2-aminoethylamino)ethylamino] propyl-trimethoxysilane (APTS) serving as the functionalizing molecule. An amino-functionalized MS polyether coating (MS-APTS) was developed on the silicone surface. The amino groups in the MS-APTS coating interact with norfloxacin (NFX) through electrostatic attraction, resulting in a target antibacterial coating (MS-NFX) containing NFX. The coating was simple to prepare and could be adapted to coat complex surfaces, and showed high adhesion and stability after 2000 bending tests without peeling or wrinkling.The MS-NFX coating achieved effective NFX release for up to 168 hours, with a sustained release of 4.84 μg/cm2 at the 168 hour for effective antimicrobial protection. In addition, the MS-NFX coating showed significant bactericidal effects against both E.coli and S.aureus, with efficacy correlating to the amount of NFX immobilized. The MS-NFX coating has the advantages of high stability, easy coating method, long effective antimicrobial time and effective antimicrobial effects, making it a promising candidate for use in biomedical catheter applications.
Keywords
泌尿外科医疗器械，如导尿管，常用于恢复因泌尿道疾病（包括癌症、脑血管疾病和肾脏疾病）而受损的泌尿功能。由于全球老龄化、肥胖和慢性病发病率的增加，导尿管市场规模逐年增长[1-2]。随之而来的，体内植入导尿管所引发的严重细菌感染和结痂并发症日益凸显[3]。据统计，几乎98%的尿路感染与重症监护病房的泌尿系统植入器械有关。此外，25%的成人脓毒症病例源于器械相关的尿路感染，死亡率高达20%~40%[4]。细菌感染通常是由植入体表面的细菌粘附并形成生物膜引起的[5]。
具有抗菌性能的功能性涂层被开发并用于改善医疗感染状况。不同涂层的作用机制不同，开发实用的多功能表面涂层仍然具有挑战性。目前抗菌涂层主要分为释放型抗菌涂层[6]和接触型抗菌涂层[7]，两种抗菌涂层有其各自的优缺点。释放型抗菌涂层由于容量有限，随着时间增长，抗菌性能减弱[8]。接触型抗菌涂层主要通过季铵盐[9]、多肽[10]等达到抗菌效果，但其表面易吸附细菌，死后的细菌不能及时从涂层上脱落，阻碍了其余细菌的进一步接触，不能达到理想的抗菌性能，因此该领域仍存在许多尚未解决的问题。此外现有的涂层方法，比如多巴胺涂层[11]，聚氨酯涂层[12]等很难紧密稳定地结合到硅胶导管表面，不利于长期应用。抗菌涂层的稳定性是直接影响导管性能和安全性的关键因素。涂层在硅胶导管上的稳定性取决于其对硅胶导尿管的粘附能力。因此提高涂层对基材的粘附，是植入导管需要解决的一个关键问题[13]。
MS聚醚由于其特殊的化学结构，结合了聚醚和有机硅两者共同的性能，具有与硅胶相似的高弹性和延展性[14-16]。因此，MS聚醚相比于聚多巴胺和聚氨酯对硅胶基材有望具有更好的附着力和稳定性。为了在MS涂层中引入抗菌分子，设计出了具有可调控氨基和亚胺基（-NHR，R=H为氨基，R=CH2为亚胺基）含量的MS-APTS涂层，并利用静电吸引原理[17]将诺氟沙星（NFX）成功固载于MS涂层中，得到具有抗菌功能的MS-NFX涂层。 NFX是一种疏水性喹诺酮类药物，在体内需要长期置入导管时作为抗菌药物应用[18]。本文制备了4种涂层材料，并结合附着稳定性和抗菌性能进行了最佳涂层的筛选，同时，对该涂层的体外释放和短期抗菌行为进行了表征。本文采用简单易行的方法制备出稳定的硅胶导管抗菌涂层，可为植入导管抗菌涂层领域提供新的思路和潜在的应用选择。
1 实验
1.1 药品与试剂
改性硅烷聚醚（MS聚醚）SAX580购于Kaneka， 3-[2-（2-氨基乙基氨基）乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷（APTS）购于阿达玛斯试剂有限公司，诺氟沙星（NFX，纯度98%）购于安徽泽升科技有限公司，二月桂酸二丁基锡（95%）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，氢氧化钠（AR）购于天津市大茂化学试剂厂，盐酸（AR）购于永飞化学试剂有限公司，三氯甲烷（AR）购于天津渤化化学试剂有限公司。
1.2 MS-NFX涂层的制备
涂层的制备流程如图1所示。按一定比例精确称取MS聚醚、APTS（MS聚醚与APTS的质量比分别为95 ∶5，90 ∶10，80 ∶20和70 ∶30），加入三氯甲烷溶液进行稀释、混合，然后再加入1%的二月桂酸二丁基锡，将1 cm×1 cm的硅胶片浸入混合溶液中5 s，取出后将带有涂层的硅胶片在室温下放置24 h，使溶剂挥发并固化。将上述4种不同比例的固化好的涂层分别命名为MS-APTS 05、 MS-APTS 10、MS-APTS 20和MS-APTS 30。
图1MS-NFX涂层的制备流程
Fig.1Preparation of MS-NFX coating
将4种分别带有不同涂层的硅胶片置于稀HCl溶液中浸泡24 h，取出后放入烘箱，60℃下干燥5 h，获得表面-NHR基团质子化的涂层硅胶片，将其分别命名为MS-N+H2R 05、MS-N+H2R 10、MS-N+H2R 20和MS-N+H2R 30涂层。精确称取一定质量的NFX加入氢氧化钠溶液（NaOH）中，将上述表面-NHR基团质子化的4种涂层硅胶片在该溶液中浸泡24 h。取出后用去离子水冲洗涂层表面，放入烘箱，60℃干燥5 h。将最终制得的固载不同含量NFX的抗菌涂层分别命名为MS-NFX 05、MS-NFX 10、MS-NFX 20和MS-NFX 30。
1.3 水接触角（WCA）表征
使用水接触角测量仪（Nikon-A1，日本Nikon公司）测定了如下样品的水接触角：-NHR基团涂层MS-APTS 05、MS-APTS 10、MS-APTS 20和MS-APTS 30；质子化的-NHR基团涂层MS-N+H2R 05、MS-N+H2R 10、MS-N+H2R 20和 MS-N+H2R 30；固载了NFX的涂层MS-NFX 05、 MS-NFX 10、MS-NFX 20和MS-NFX 30。设置接触角测量仪的出水量为3 μL，将水滴在涂层表面，5 s内测量涂层表面的水接触角。根据方差检验，最终测量值为在不同位置测量出的3个接触角的平均值±标准差（x± s）。
1.4 涂层元素组成及形貌表征
使用X射线光电子能谱仪（AXIS U1tra，THERMO SCIENTIFIC）测试MS-APTS 20涂层和MS-NFX 20涂层表面元素组成及变化。采用场发射扫描电子显微镜（MIRA3 GM，卡尔蔡司）观察MS-NFX 05、MS-NFX 10、MS-NFX 20和MS-NFX 30 4种涂层的微观形态。用手术刀将附着MS-NFX 20涂层的商品导尿管纵向切成厚度为1 mm的样品，在SEM下观察涂层的横切面。
1.5 涂层稳定性表征
对附着MS-NFX 05、MS-NFX 10、MS-NFX 20 和MS-NFX 30 4种涂层的硅胶导尿管分别进行了2 000次的弯折实验，弯折角度约为150°，探究涂层在硅胶导尿管表面的附着稳定性。并采用场发射扫描电子显微镜观察2 000次弯折实验后4种涂层的微观形态。
1.6 MS-NFX 20涂层体外释放实验
配制0.5、1、5 和10 μg/mL的NFX钠盐标准溶液，使用紫外分光光度计（U-3310，日本HITACHI公司）测试上述标准溶液的紫外吸收光谱。根据紫外吸收的最大吸收强度和溶液浓度，绘制NFX的紫外吸收标准曲线。
将固载NFX的MS-NFX 20涂层涂覆在直径为5 mm的圆形硅胶片上，在37℃下，将该涂层硅胶片置于8 mL的PBS缓冲溶液（pH=7.4）中，0.5 h后取出其中的3 mL溶液，再重新加入3 mL新鲜的PBS缓冲液，取出的溶液在200~400 nm的扫描波长下得到UV-Vis谱。在涂层硅胶片置于PBS缓冲溶液2、8、24、48、72 以及168 h后重复以上操作。最终测量值为3次平行实验结果的平均值±标准差（x± s）。
1.7 MS-NFX涂层抑菌性能实验
采用抑菌圈法，通过测试固体培养基上抑菌圈的直径（d）来探究样品抗菌活性。将108 CFU/mL 的E.coli和S.aureus菌液分别涂布在固体培养基上。然后，将MS-APTS 20、MS-NFX 05、MS-NFX 10、 MS-NFX 20和MS-NFX 30 5种涂层样品分别裁剪成直径为5 mm的圆片。将所得圆片涂层样品分别放置于涂布好的培养基上，每个培养皿放3片相同的圆片涂层样品。将所有制备好的样品培养基放入37℃恒温培养箱（250B，常州恒隆仪器有限公司）中培养16 h。以MS-APTS 20为对照组，测量抑菌圈的直径，测量值以平均值±标准差（x±s）表示，并分析测量结果。
2 结果与讨论
2.1 接触角表征结果
图2给出了MS-APTS、MS-N+H2R和MS-NFX 3种类型涂层12种不同成分表面的水接触角的结果。
图23种不同类型涂层的12种涂层表面的水接触角
Fig.2Water contact angle of 12 coated surfaces with 3 different types of coatings
APTS中含有-NH2基团，-NH2基团为亲水基团，随着APTS的比例增大，MS-APTS涂层的接触角如图2（黄色柱）从左到右依次减小，涂层亲水性增强，其中含-NHR基团最多的MS-APTS 30涂层的接触角为93°。MS-N+H2R涂层（图2绿色柱）由于-NHR基团质子化，亲水性进一步增加，其也呈现随着-N+H2R基团含量的增加，亲水性增强的趋势，MS-N+H2R 30涂层的接触角为90°。由于NFX为疏水结构，NFX引入涂层后（图2紫色柱），使涂层接触角明显增加，MS-NFX 30涂层的接触角可达119°，涂层疏水性增强。通过对涂层表面亲水性的研究，证实了每一种涂层的成功得到，更重要的是间接证明了NFX成功静电吸引作用于涂层表面。
2.2 涂层的XPS表征结果
由图3（a）中MS-APTS 20 涂层和MS-NFX 20涂层的全谱扫描图可知，MS-NFX 20涂层谱图在689.8 eV处多出一个强峰，该峰归属于F1s。图3（b）对F1s峰进行了放大，发现该峰只含有同一种化学结构的F元素，其来自于NFX，可以明确判断NFX接枝到了涂层表面。图3（c）、（d）对两个涂层的N 1s核心能级谱进行分析，图3（c）在399.1 eV处的强峰为-NHR基团中的N元素特征峰，图3（d）在399.1eV处的-NHR基团中的N元素特征峰变弱，同时在405.1 eV处出现了与NFX分子中的羧基成盐后所形成的-N+H2R基团中的N 1s峰，该峰证实了NFX以离子形式成功接枝在涂层表面。
固化后形成的MS-APTS涂层中的-NHR基团在稀HCl溶液中浸泡后，表面的-NHR 基团质子化为N原子上带正电荷的-N+H2R基团。在NFX钠盐溶液中，NFX-COO-Na+与-N+H2R基团充分反应，由于两者带有相反电荷所以产生静电吸引作用，从而成功将NFX接枝于MS-APTS 涂层表面，最终得到抗菌涂层MS-NFX。
图3XPS谱图：（a）MS-APTS 20和MS-NFX 20涂层的宽扫描谱图；（b）MS-NFX 20涂层的F1s核心能级谱图；（c）、（d）分别为MS-APTS 20和MS-NFX 20涂层的 N 1s核心能级谱图
Fig.3XPS spectra: (a) XPS broad-scan spectra of MS-APTS 20 coating and MS-NFX 20 coating; (b) F1s core energy level spectra of MS-NFX 20 coating; (c) , (d) N 1s of MS-APTS 20 coating, MS-NFX 20 coating respectively core energy level spectra
2.3 MS-NFX涂层的形貌及稳定性
图4（a）~（d）给出了4种MS-NFX涂层的形貌，可见，MS-NFX 05、MS-NFX 10的表面相对平整；MS-NFX 20、MS-NFX 30涂层由于APTS含量较高，表面质子化的-NHR基团较多，接枝到表面的NFX含量高。APTS与NFX形成离子键，离子键属于强极性基团，与弱极性的MS聚醚相容性不好，所以容易在表面析出晶体或者造成表面不平整的形貌。图4（d）可以明显看到涂层表面有NFX的针状结晶，同时图4（c）表面也出现了较轻微的结晶。
图4涂层表面形貌
Fig.4Coating surface morphology: (a) MS-NFX 05; (b) MS-NFX 10; (c) MS-NFX 20; (d) MS-NFX 30
图5（a）将带有MS-NFX 20涂层的导尿管和不带涂层的导尿管进行宏观对比，可以看出，导尿管没有因为涂层的涂覆而产生宏观形貌上的明显区别，带有MS-NFX 20涂层的导尿管由于NFX 以及MS聚醚的引入出现了轻微的黄色。图5（b）为不带涂层的硅胶导尿管，可以看出其外表面比较光滑。图5（c）为表面带有MS-NFX 20涂层的硅胶导尿管的SEM图，可以看出，MS-NFX 20涂层在导尿管表面附着良好，没有任何空鼓或者粘附不紧密的情况出现，且涂层厚度适中，约为100 μm。
图6（a）~（d）给出了4种MS-NFX涂层2 000次的弯折后的宏观形貌，可见，MS-NFX 05、MS-NFX 10和MS-NFX 20涂层的硅胶导尿管表面没有明显褶皱和脱落，稳定性良好，MS-NFX 30涂层表面则出现了轻微脱落现象。图6（e）~（h）的微观形貌结果表明，2 000次的弯折实验后，MS-NFX 05、MS-NFX 10和MS-NFX 20涂层的硅胶导尿管表面仍保持完整，与弯折实验前的涂层形貌没有明显差别；而MS-NFX 30涂层表面出现了褶皱凸起，说明其对硅胶导尿管的附着力相对较差。综合考虑涂层稳定性和表面NFX含量，选择MS-NFX 20为最佳涂层。
图5涂层界面形貌：（a）MS-NFX 20涂层和无涂层导尿管宏观照片；（b）无涂层导尿管横切面形貌；（c）MS-NFX 20涂层导尿管横切面形貌
Fig.5Coating interface morphology: (a) macrophotograph of MS-NFX 20 coated and uncoated catheters; (b) cross-sectional morphology of uncoated catheter; (c) cross-sectional morphology of catheter coated with MS-NFX 20
2.4 MS-NFX 20涂层的体外释放实验
图7为MS-NFX 20涂层中NFX的持续释放曲线和累积释放曲线。由图7（a）可知，NFX在前8 h快速释放，8 h后释放放缓。由图7（b）可得到NFX在前8 h释放量约65%。最初的快速释放可能是由于涂层表面接枝的NFX含量较高，涂层表面NFX浓度远大于释放缓冲液中NFX浓度，使NFX快速释放。随着释放时间的增长，表面的NFX含量降低，8 h后仍能持续缓慢释放。研究表明NFX的最小抑菌浓度为0.041 μg/mL[19]， MS-NFX 20涂层在第168 h的持续释放量为4.84 μg/cm2，仍能达到有效表面抑菌浓度。
图62 000次弯折实验后MS-NFX 05、MS-NFX 10、MS-NFX 20、MS-NFX 30涂层的宏观照片（a）、（b）、（c）、（d）和表面微观形貌（e）、（f）、（g）、（h）
Fig.6Macroscopic photographs (a) , (b) , (c) , (d) and surface micromorphology (e) , (f) , (g) , (h) of MS-NFX 05, MS-NFX 10, MS-NFX 20, MS-NFX 30 coatings after 2 000 bending experiments
图7NFX在PBS缓冲液中的释放曲线：（a）持续释放；（b）累积释放
Fig.7Release curves of NFX in PBS buffer: (a) sustained release; (b) cumulative release
2.5 MS-NFX涂层的抗菌性能研究
为了更好的对比各种涂层的抗菌性能，抗菌实验中本文仍然选择全部4种MS-NFX 05，MS-NFX 10，MS-NFX 20，MS-NFX 30涂层样品进行测试，MS-APTS 20涂层作为空白对照，结果如图8所示。
图8MS-APTS 20、MS-NFX 05、MS-NFX 10、MS-NFX 20、MS-NFX 30涂层对S.aureus（a）、（b）、（c）、（d）、（e）和E.coli（f）、（g）、（h）、（i）、（j）的抗菌结果
Fig.8Antimicrobial results of MS-APTS 20, MS-NFX 05, MS-NFX 10, MS-NFX 20, MS-NFX 30 coatings on S.aureus (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , and E.coli (f) , (g) , (h) , (i) , (j)
随着APTS含量增加，表面NFX含量也增加，抑菌圈的直径增大。表1为抑菌圈的直径的测量结果，可见，MS-NFX 30 涂层对S.aureus和E.coli 的抑制作用均是MS-NFX 05涂层的1.30倍，MS-NFX 20涂层对S.aureus和E.coli的抑制作用分别是MS-NFX 05涂层的1.14倍和1.16倍，且MS-NFX 20和MS-NFX 30涂层的抑菌圈直径差异较小。因此综合抗菌性能以及涂层抗弯折稳定性考虑，MS-NFX 20涂层为硅胶导尿管表面最佳的抗菌涂层。综合体外释放和抑菌实验的结论，MS-NFX涂层的抗菌行为应为释放抗菌机理，其释放出的NFX可大范围抑制两种细菌的生长。NFX为临床常用广谱抗菌药物，这种抗菌药物与合成细菌DNA所需的DNA回旋酶以及拓扑异构酶IV结合形成复合物，阻碍DNA的复制与转录，最终启动细菌凋亡机制使其死亡[20]。综上，MS-NFX涂层的抗菌机理可能为：首先，NFX从MS-NFX涂层中释放到介质中；其次，释放出的NFX遵循其固有抗菌机理实现细菌杀灭功能。
表1MS-NFX涂层对应金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制圈直径
Table1Inhibition circle diameters of S.aureus and E.coli by MS-NFX coatingsmm
3 结论
1）通过表面预涂覆含有-NHR基团的MS-APTS涂层，再通过静电吸引作用制备得到了MS-NFX涂层，该涂层可以均匀稳定的涂覆在硅胶导尿管上或其它硅胶基材表面。
2）通过水接触角实验得出了MS-APTS、MS-N+H2R、MS-NFX 3种类型涂层的表面亲水性变化规律，辅证了MS-NFX涂层的成功制备。在XPS测试中，MS-NFX涂层的XPS谱图中F1s信号和与NFX分子中的羧基成盐后的-N+H2R基团中的N 1s信号的出现，进一步证实了NFX表面接枝的成功。SEM结果表明，MS-NFX涂层在导尿管上可以良好附着，厚度约100 μm。稳定性实验表明，经过2 000次弯折后，MS-NFX 05，MS-NFX 10，MS-NFX 20涂层稳定性均良好，而MS-NFX 30涂层出现轻微脱落。综合考虑涂层稳定性和表面NFX含量，初步认为MS-NFX 20为最佳涂层。
3）体外释放实验表明MS-NFX 20涂层中的NFX前8 h快速释放约65%，8 h后实现缓慢释放，第168 h的持续释放量为4.84 μg/cm2，仍能达到有效表面抑菌浓度。MS-NFX涂层抗菌实验结果表明随着涂层表面接枝的NFX含量增加，抑菌圈直径增大，抗菌效果增强。MS-NFX 20，MS-NFX 30涂层抑菌圈直径差异较小，因此进一步确定MS-NFX 20为最佳涂层，该涂层有望用于进一步的研究或实际应用。
