摘要
辣椒素是辣椒中的活性成分，因其良好的抗菌、抗氧化和防污特性而备受关注。酚酸是一类同时含有羟基和羧基的化合物，具有清除自由基和抗氧化等生理活性。合成了兼具1到3个酚羟基和酰胺活性基团的2,6-二丙烯酰胺甲基-3,4,5-三羟基羧基苯甲酸(A)，3,5-二丙烯酰胺甲基-2,6-二羟基苯甲酸(B)，2,6-二丙烯酰胺甲基-3,5-二羟基苯甲酸(C)，N-(2-苯甲酸-2,4-二羟基-5-苯甲酰胺甲基苄基)苯甲酰胺(D)、 N-(2,3,4-三羟基-5-丙烯酰胺甲基苄基)丙烯酰胺(E)、3,5-二丙烯酰胺甲基-2,6-二羟基苯乙酮(F)和 2,4-二丙烯酰胺甲基-6-叔丁基间甲酚(G)等7种辣素衍生物，并通过红外光谱、1H NMR和13C NMR进行表征。化合物的抗氧化活性通过还原力测试和DPPH自由基清除能力测试进行评估，抑菌活性通过测定对大肠杆菌的抑制作用进行评估。结果表明，7种辣椒素衍生物均具有一定的抗氧化和抗菌活性，其中，酚酸辣素衍生物A的抗氧化活性与维生素C相似，抑制率EC50为7.953 μg/mL，质量浓度为3 mg/mL时的抑菌率为99.18%。酚酸辣椒素衍生物在食品、医药和化妆品领域具有更大的发展潜力。
Abstract
Capsaicin, as an active ingredient in chili peppers, has garnered significant attention because of its excellent physiological activities such as antimicrobial, antioxidant and antifouling properties. Phenolic acids are a class of compounds containing both hydroxyl and carboxyl groups, which have physiological activities such as free radical scavenging and antioxidantactivity. In this study, a total of seven capsaicin derivatives 2,6-Diacrylamidomethyl-3,4,5-trihydroxycarboxybenzoic acid (A), 3,5-Diacrylamidomethyl-2,6-dihydroxybenzoic acid (B), 2,6-Diacrylamidomethyl-3,5-dihydroxybenzoic acid (C), N-(2-Benzoic acid-2,4-dihydroxy-5-benzamidomethylbenzyl)benzamide (D), N-(2,3,4-Trihydroxy-5-acrylamidomethylbenzyl) acrylamide (E), 3,5-Diacrylamidomethyl-2,6-dihydroxyacetophenone (F), and 2,4-Diacrylamidomethyl-6-tert-butyl-m-cresol (G) with one to three phenolic hydroxyl and amide reactive groups were synthesized, each containing 1 to 3 phenolic hydroxyl and amide active groups. These capsaicin derivatives were characterized by IR, 1H NMR and 13C NMR. The antioxidant activity of the compounds was evaluated by reducing power test and DPPH radical scavenging capacity test. The bacteriostatic activity was evaluated by the determination of E.coli bacterial inhibition. From the results, all seven capsaicin derivatives possess certain levels of antioxidant and antibacterial activities. Among them, the phenolic acid capsaicin derivative A shows antioxidant activity similar to VC with an EC50 of 7.953 μg/mL and a bacterial inhibition rate of 99.18% at a mass concentration of 3 mg/mL. Phenolic acid capsaicin derivatives have significant potential for development in the food, pharmaceutical and cosmetic fields.
健康、有效的食品以及药品等是人们关注的热点话题，天然、环保、无毒无害的产物开发亦越来越受到重视。辣素是具有斥水亲脂、无色无嗅的结晶或蜡状物质，作为辣椒属植物的主要活性成分，辣素具有良好的抑菌、防污、抗氧化、消炎以及止痛等丰富的生物活性[1-3]，且在涂料[4-5]、医药[6-7]、食品[8-9]等多个领域具有广泛的应用。酚酸是一类存在于植物中的次生代谢产物[10]，分布广泛，种类繁多，其同时具有羧基和1到3个酚羟基。酚酸类化合物具有抗氧化、抗菌等生物活性，在医药、食品以及化妆品等领域有着广泛的应用[11]。为了更好地实现辣素的实际意义，满足实际应用的需要，科学家们发现了许多与天然辣素结构和功能相似的化合物——辣素衍生物[12]。利用简单的化学方法合成的具有相似生物活性和健康友好特性的辣素衍生物具有高效以及高选择性的优势，具有重要的现实意义[13]。
自由基是具有不成对电子的原子或基团。自由基的不稳定性以及其过量时会引起氧化反应，进而导致炎症、免疫系统疾病、心脑血管疾病以及加速生物衰老等不良影响[14]。适当补充抗氧化剂或自由基清除剂可以有效预防或抑制这些疾病[15]，寻找良好的抗氧化剂成为当前的研究热点。目前大部分自由基清除剂是酚类化合物，酚酸的抗氧化能力中心即是酚羟基，其可以捕获自由基而达到抗氧化的效果，抗氧化能力的强弱与其共振结构及分子内外的氢键有关[16]，因此酚羟基的数量和位置直接关系到酚酸的抗氧化能力。同时，酰胺基团以及酚羟基的存在可以破坏细菌细胞膜，从而达到抑菌的效果。
因此，本文设计合成了7种辣素衍生物，其中4种兼具酚酸结构，并对它们的抗氧化和抗菌活性进行了研究和分析，为具有良好抗氧化及抗菌活性的绿色产品的合成提供了理论指导，拓宽了辣素衍生物的种类，为辣素衍生物在食品、医药和化妆品等领域的应用开拓了新的思路。
1 实验
1.1 试剂与仪器
N-羟甲基丙烯酰胺，GR，淄博市临淄颐中化工有限公司；N-羟甲基苯甲酰胺，GR，北京成宇化工有限公司；没食子酸、2，6-二羟基苯乙酮、2，6-二羟基苯甲酸、3，5-二羟基苯甲酸、6-叔丁基间甲酚、焦性没食子酸、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、维生素C（VC）、二甲基亚砜、H2SO4（质量分数98%）、NaCl，AR，国药集团化学试剂有限公司；1，1-二苯-2-苦基，AR，飞净科研试剂有限公司；营养琼脂、营养肉汤，AR，北京陆桥技术股份有限公司；大肠杆菌（E.coli）来自中国海洋大学生命学院微生物实验室。
SCA 210电子分析天平，梅特勒托利多称重系统有限公司；OSB-2100油浴锅，上海爱朗仪器有限公司；AVANCE-Ⅲ600 mHz超导核磁共振波谱仪，瑞士布鲁克公司；AVATAR-360红外光谱仪，美国NICOLET公司；U-2800紫外可见分光光度计，日本HITACHI公司；MLS-3750高压蒸汽灭菌器，日本三洋电机株式会社；SW-CJ-2F超净工作台，苏净集团安泰公司；SPX-160B电热恒温培养箱，上海福玛实验设备有限公司。
1.2 辣素衍生物的合成
参照Wang等[17-18]合成辣素衍生物的过程，本文将100 mL无水乙醇加入到盛有原料没食子酸（17.01 g，0.1 mol）以及N-羟甲基丙烯酰胺（24.26 g，0.24 mol）的250 mL三口烧瓶中，搅拌的同时缓慢滴入10 mL浓硫酸作为催化剂，3 h后再将油浴锅慢慢升温至合适温度，整个反应历时72~96 h，并用TLC监控。反应结束后，减压过滤，滤饼用去离子水充分洗涤至中性，即得粗产物，再用无水乙醇进行重结晶，即可得纯产物A，其他辣素衍生物的合成方法同上，具体合成条件如表1所示，合成过程如图1所示。
1.3 辣素衍生物的抗氧化活性测试
1.3.1 自由基清除活性的测定
依据Brand-williams等[19]和Mareĉek等[20]的方法，测定辣素衍生物清除稳定自由基的能力。DPPH自由基（DPPH·）是一种深紫色的稳定自由基，含一个未成对电子，其与抗氧化剂接触时，可以接受一个电子或氢离子，未成对电子被捕捉，在最大光吸收波长517 nm[21]处的吸光值下降且颜色变为浅黄色。该方法简单、快速且低成本，广泛用于辣素的抗氧化活性测试[22-23]。在517 nm下测定不同溶液的吸光度，并计算辣素衍生物对DPPH·的清除率，以评价辣素衍生物消除自由基的能力。将含不同质量浓度辣素衍生物（0、10、20、30、40、50、60 μg/mL）的乙醇溶液（2.0 mL）和1，1-二苯-2-苦基肼（DPPH）溶液（2 mL，0.1 mmol/L）加入到10 mL的离心管中，在黑暗条件下的30℃水浴震荡箱中反应30 min，测量OD517。测定3个平行重复实验数据，表示为平均值±标准偏差。实验结果显示为清除率和半最大效应浓度（EC50），维生素C（VC）[24]用作对照。
(1)
式中：E为对DPPH·的清除率；Es为样品组（样品溶液+DPPH·）的OD517；Eb空白组（样品溶液+乙醇）的OD517；Ec对照组（乙醇+DPPH·）的OD517。
1.3.2 还原力的测定
根据Ferreira和Oyaizu等[25-27]的方法测定辣素衍生物的还原力。还原力的测定是以普鲁士蓝为指标，抗氧化剂可以将铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]）还原，Fe（CN）3-6还原为Fe（CN）4-6，再与试液中的三氯化铁（FeCl3）反应生成在700 nm处有最大吸光度的普鲁士蓝。因此测定OD700可以间接反映抗氧化剂的还原能力大小。将1.0 mL含不同质量浓度辣素衍生物（0、10、20、30、40、50、60 μg/mL）的乙醇溶液、1.0 mL pH=6.6的磷酸盐缓冲溶液（NaH2PO4）和1.0 mL 铁氰化钾（K3[Fe（CN）6]，质量分数1%）加入到10 mL离心管中，将混合溶液在50℃下反应20 min后立即冷却，然后加入1.0 mL三氯乙酸（C2HCl3O2，质量分数10%）。最后，将1.0 mL上述混合物、1.0 mL去离子水和0.2 mL三氯化铁（FeCl3，质量分数0.1%）添加到另一个10 mL离心管中，室温下反应5 min后测量OD700，OD700值越高表明还原能力越强。测定3个平行重复值，实验数据表示为平均值±标准偏差，实验结果显示为吸光度，维生素C（VC）用作对照。
表1辣素衍生物的合成细节
Table1Synthetic details of capsaicin derivatives
图1辣素衍生物的合成
Fig.1Synthesis of capsaicin derivatives
1.4 抑菌活性实验
大肠杆菌（E.coli）是常见的代表性革兰氏阴性菌，在食品中分布十分广泛，采用稀释涂布平板法进行抑菌实验，测试化合物的抑菌率[28-29]。实验过程如图2所示，首先将充分活化的菌接种于液体培养基，培养24 h后将菌液稀释至OD600为0.1左右备用。将0.1 mL的菌悬液、1 mL 3 mg/mL的辣素衍生物丙酮溶液和13.9 mL的液体培养基加入到20 mL离心管中。在恒温培养箱中培养18 h，然后用移液枪将200 μL培养好的溶液滴在固体培养基中用涂布棒均匀的涂抹至完全吸收，继续培养18 h后计算活菌数，每个样品的每个浓度重复实验3次，以不加辣素衍生物的丙酮溶剂为对照组。
图2抑菌实验过程
Fig.2Bacteriostatic experimental procedure
抑菌率由下式得出
(2)
式中：R为抑菌率；Ri为处理组（辣素衍生物的丙酮溶液）的菌数；R0为对照组（丙酮）的菌数。
2 结果与讨论
2.1 辣素衍生物的结构表征
图3~图5给出了合成的7种辣素衍生物的表征结果。
A：白色固体粉末，产率：82.59%，熔点：304.8~306.1℃。IR（KBr）ν: 819.08，984.32，1 119.64，1 596.84，1 619.21，1 663.68，1 710.80，3 132.44，3 310.50，3 442.34 cm-1; 1H NMR（DMSO，600 MHz）δ: 10.45（s，1H，OH），9.56（s，1H，OH），9.50（s，1H，OH），9.09（t，J=6.00 Hz，2H，NH），7.66（m，1H，=CH2），6.44（m，1H，=CH2），6.20（d，J=6.00Hz，1H，=CH2），6.19（m，1H，=CH2），5.94（m，2H，=CH），4.68（s，1H，CH2），4.67（s，1H，CH2），4.59（s，2H，CH2）; 13C NMR（DMSO，150 MHz）δ: 2.89，45.52，118.13，122.55，127.33，130.04，130.66，130.67，140.19，141.07，146.17，165.16，167.49，168.46。
图37种辣素衍生物的IR
Fig.3IR of 7 capsaicin derivatives
B：白色固体粉末，产率：78.26%，熔点：162.2~164.5℃。IR（KBr）ν: 816.23，978.63，1 129.61，1 464.37，1 562.66，1 626.76，1 670.92，3 089.76，3 246.70，3 336.14 cm-1; 1H NMR（DMSO，600 MHz）δ: 9.78（s，2H，OH），8.3（t，J=6.00 Hz，2H，NH），7.10（s，1H，PhH），6.28（m，2H，=CH2），6.11（d，J=6.00 Hz，1H，=CH2），6.08（d，J=2.2 Hz，1H，=CH2），5.58（d，J=6.00 Hz，1H，CH=），5.57（d，J=6.00 Hz，1H，CH=），4.19（d，J=6.00 Hz，4H，CH2）; 13C NMR（DMSO，150 MHz）δ: 37.53，102.00，115.41，125.62，132.13，134.55，158.49，165.15，173.88。
C：黄棕色固体粉末，产率：55.63%，熔点：286.3~289.8℃。IR（KBr）ν: 859.76，985.64，1 239.07，1 481.31，1 645.40，1 616.62，1 653.65，3 096.44，3 287.36，3 412.70 cm-1; 1H NMR（DMSO，600 MHz）δ: 10.12（s，1H，COOH），9.95（s，1H，OH），9.86（s，1H，OH），8.64（t，J=6.00 Hz，1H，NH），8.56（t，J=6.00 Hz，1H，NH），6.52（s，1H，PhH），6.32（m，4H，=CH2），5.60（m，2H，CH=），4.29（d，J=6.00 Hz，2H，CH2），4.09（d，J=6.00 Hz，2H，CH2）; 13C NMR（DMSO，150 MHz）δ: 37.37，109.04，114.22，120.65，126.97，131.15，153.22，158.08，165.88，168.60，169.26。
图47种辣素衍生物的1H NMR
Fig.41H NMR of 7 capsaicin derivatives
D：浅粉色固体粉末，产率：48.81%，熔点：266.1~266.8℃。IR（KBr）ν: 712.17，984.32，1 129.49，1 489.85，1 545.40，1 622.31，1 693.53，3 077.98，3 327.24，3 438.34 cm-1; 1H NMR（DMSO，600 MHz）δ: 10.65（s，1H，COOH），10.39（s，1H，OH），9.51（t，J=6.00 Hz，1H，NH），9.37（t，J=6.00 Hz，1H，NH），8.63（s，1H，phH），7.92（d，J=6.00 Hz，2H），7.89（d，J=6.00 Hz，2H），7.55（d，J=6.00 Hz，2H），7.54（d，J=6.00 Hz，2H），7.48（d，J=6.00 Hz，2H），7.47（d，J=6.00 Hz，2H），4.96（d，J=6.00 Hz，2H，CH2），4.53（d，J=6.00 Hz，2H，CH2）; 13C NMR（DMSO，150 MHz）δ; 34.39，114.63，116.92，123.49，127.97，128.06，128.87，131.12，132.11，133.74，151.64，155.78，168.50，169.28，171.59。
E：白色固体粉末，产率：82.36%，熔点：188.2~191.5℃。IR（KBr）ν:806.61，960.28，1 071.50，1 460.07，1 549.34，1 588.12，1 656.18，2 925.05，3 104.33，3 274.83 cm-1; 1H NMR（DMSO，600 MHz）δ: 9.51（s，1H，OH），9.11（s，2H，OH），8.68（t，J=6.00 Hz，2H，NH），6.44（s，1H，PhH），6.28（d，J=12.00 Hz，1H，=CH2），6.25（d，J=12.00 Hz，1H，=CH2），6.15（d，J=3.00 Hz，1H，=CH2），6.12（d，J=3.00 Hz，1H，=CH2），5.64（d，J=6.00 Hz，1H，CH=），5.62（d，J=3.00 Hz，1H，CH=），4.17（s，2H，CH2），4.16（s，2H，CH2）; 13C NMR（DMSO，150 MHz）δ: 38.67，116.80，120.43，126.38，131.59，134.28，144.00，166.00。
F：黄色固体粉末，产率：92.26%，熔点：103.2~200.7℃。IR（KBr）ν: 804.83，957.25，1 103.97，1 119.64，1 548.41，1 669.50，3 076.89，3 230.73，3 367.87 cm-1; 1H NMR（DMSO，600 MHz）δ: 12.39（s，2H，OH），8.91（t，J=6.0 Hz，2H，NH），7.26（s，1H，PhH），6.27（m，4H，=CH2），6.18（dd，J=17.1，2.1Hz，1H），5.69（d，J=6.00 Hz，1H，CH=），5.58（d，J=6.00 Hz，1H，CH=），4.22（d，J=6.00 Hz，4H，CH2），2.69（s，3H，CH3）; 13C NMR（DMSO，150 MHz）δ: 33.96，38.28，111.73，116.90，126.99，131.14，138.03，159.48，166.55，206.21。
图57种辣素衍生物的13C NMR
Fig.513C NMR of 7 capsaicin derivatives
G：白色固体粉末，产率：89.26%，熔点：208.5~210.2℃。IR（KBr）ν:804.83，1 079.76，1 240.72，1 462.95，1 555.54，1 619.64，1 560.98，2 955.80，3 096.89，3 256.37cm-1; 1H NMR（DMSO，600 MHz）δ: 10.27（s，1H，OH），9.33（t，J=6.00Hz，1H，NH），8.23（t，J=6.00 Hz，1H，NH），7.05（s，1H，PhH），6.21（m，4H，=CH2），5.71（d，J=6.00 Hz，1H，CH=），5.56（d，J=6.00 Hz，1H，CH=），4.27（dd，J=6.00 Hz，4H，CH2），2.22（s，3H，CH3），1.33（s，9H，CH3）；13C NMR（DMSO，150 MHz）δ: 15.07，29.88，30.08，34.67，36.61，42.14，125.76，127.50，127.83，130.33，132.15，135.02，154.45，164.53，167.72。
由表征结果可知辣素衍生物被成功合成，它们的结构和名称如表2所示。
表2辣素衍生物的名称及结构
Table2Names and structures of capsaicin derivatives
2.2 DPPH自由基清除能力
采用DPPH·法测定化合物的自由基清除活性，得到EC50列于表3，另外，为了更加直观的看出不同化合物的抗氧化活性，选取30 μg/mL处的DPPH自由基清除率作柱状图。由图6中结果我们可以看出，DPPH·清除率大小依次为：VC＞A＞E＞B＞D＞C＞F＞G，且清除率随着化合物质量浓度的增加而增加，VC的DPPH·清除率在实验选取的浓度范围内基本不变，保持在70%以上。化合物的酚羟基能有效地捕获氢原子，并将氢原子提供给DPPH·，然后苯酚羟基转化苯酚氧自由基，并通过苯酚与苯环的共轭稳定苯酚氧自由。当苯环上的酚羟基数目小于4时，化合物的抗氧化活性基本与酚羟基数目成正比。
表3DPPH自由基清除实验EC50
Table3EC50 values for DPPH free radical scavenging assay
可见，化合物A和E的效果与VC相似，半最大效应浓度EC50值分别为7.935、9.038和7.097 μg/mL，B、C、D、F由于都含有两个酚羟基，所以清除率基本相当，其中的微小差距是因为其他基团的存在，—COOH的存在有利于稳定特定自由基，增强自由基清除能力。A、E除了具有最多的酚羟基外，其羟基位于邻位，可以获得更高的抗氧化活性。另外，由于G只有一个酚羟基，所以其自由基清除能力最低。
图6辣椒素衍生物清除DPPH·的能力：（a）清除率随化合物质量浓度变化曲线；（b）化合物质量浓度为30 μg/mL时的DPPH·清除率
Fig.6DPPH· clearance ability of capsaicin derivatives: (a) curve of clearance rate vs. compound mass concentration; (b) DPPH· clearance rate at compound mass concentration of 30 μg/mL
2.3 还原能力
抗氧化的物质通过自身还原作用，给出电子，消除自由基，由此可以获知，还原能力越强，抗氧化性越强，另外还原力与吸光度有关，吸光度越大，还原力越强[30-31]。以普鲁士蓝为指标测定还原能力，Fe2+的浓度可以在700 nm处显示普鲁士蓝的形成，因此，可以通过测量700 nm处样品的吸光度来达到监测样品还原力大小的目的。通过吸光度值可以得到还原力的大小，同样，为了更加直观的看出不同化合物的抗氧化活性，选取化合物质量浓度为30 μg/mL处的吸光度值作柱状图。由图7的结果可以看出，吸光度值OD700随着化合物质量浓度的增加而增加，化合物A和E的吸光度值与VC相近，这是因为它们具有较多的酚羟基，所以具有较多的电子供体用以还原铁离子，化合物B、C、D、F因为具有两个酚羟基而吸光度值相近，而G因为含酚羟基等活性基团最少而导致吸光度值最低，以此可以得出其还原力的大小依次为：VC＞A＞E＞B＞D＞C＞F＞G，与DPPH自由基清除实验的结果一致。
图7辣素衍生物的还原能力:（a）吸光度随化合物质量浓度变化曲线；（b）化合物质量浓度为30 μg/mL时的吸光度
Fig.7Reduction capacity of capsaicin derivatives: (a) curve of absorbance variation vs. compound mass concentration; (b) absorbance at compound mass concentration of 30 μg/mL
2.4 抑菌活性
辣素衍生物的抑菌能力如图8（a）、（b）所示，可以看出，7种辣素衍生物都具有良好的抑菌效果，其抑菌率基本都在80%以上，抑菌率大小依次为A≈E＞B≈D≈C≈F＞G。辣素衍生物的抑菌活性与其结构有关，苯环、酰胺基团及酚羟基是辣素衍生物具有抗菌活性的关键结构，酚羟基使化合物具有类似鞣质的特性，不仅具备收敛性，还会破坏微生物体内的原生质，以达到抑菌效果。另外，辣素衍生物中的其他基团的存在也会对抗菌活性产生一定的影响，羧基的存在可以在一定程度上提高抗菌活性，因此我们可以看到含有羧基和3个酚羟基的A抗菌活性最高，而仅含VC一个酚羟基的化合物G活性最低。辣素衍生物的抑菌原理如图8（c）所示，辣素衍生物接触甚至进入细菌内部，光滑的细菌表面逐渐变褶皱甚至破裂，细菌内部营养物质流出，使其无法继续生存和繁殖[32-33]。
图8辣素衍生物的抑菌效果（a）、抑菌率（b）以及抑菌原理（c）
Fig.8Antibacterial effects (a) , antibacterial rate (b) and antibacterial mechanism (c) of capsaicin derivatives
3 结论
1）本文以酰胺类化合物和芳香族化合物为原料，通过F-C反应合成了7类辣素衍生物，并通过红外光谱，核磁氢谱和碳谱对其进行表征，结果表明辣素衍生物为设计结构化合物。
2）抗氧化活性是通过DPPH自由基清除实验以及还原力实验来测定的，实验结果表明化合物A具有最高的抗氧化活性，在DPPH自由基清除实验中EC50可以达到7.935 μg/mL，与对照组VC（EC50=7.097 μg/mL）的抗氧化能力基本相当，这与其结构中含有较多的酚羟基有关，且羧基的存在可以增强其抗氧化能力。
3）通过对大肠杆菌的抑制作用来测定化合物的抗菌活性，实验结果表明因为酰胺基团、苯环以及酚羟基的配合作用，所制备的化合物均具有良好的抑菌活性，其中又以A效果最好，对大肠杆菌的抑制率高达99.18%。
化合物A兼具酚酸类化合物以及辣素衍生物的活性，具有良好的抗氧化和抑菌能力，为辣素衍生物在食品、医药、化妆品等行业中的应用拓展了新思路。
